Блог

Sep 06, 2023

Разработка de novo модульных и настраиваемых белковых биосенсоров

Природа том 591, стр.

Nature, том 591, страницы 482–487 (2021 г.) Процитировать эту статью

58 тысяч доступов

91 цитат

377 Альтметрика

Подробности о метриках

Естественные белковые переключатели были перепрофилированы для разработки биосенсоров и репортеров для клеточных и клинических применений1. Однако количество таких коммутаторов ограничено, и их реинжиниринг представляет собой сложную задачу. Здесь мы показываем, что общий класс биосенсоров на основе белков может быть создан путем инвертирования потока информации через разработанные de novo белковые переключатели, в которых связывание пептидного ключа запускает интересующие биологические результаты2. Разработанные сенсоры представляют собой модульные молекулярные устройства с закрытым темновым состоянием и открытым люминесцентным состоянием; связывание аналита переводит переключатель из закрытого в открытое состояние. Поскольку в основе сенсора лежит термодинамическая связь связывания аналита с активацией сенсора, требуется только один целевой домен связывания, что упрощает конструкцию сенсора и позволяет осуществлять прямое считывание данных в растворе. Мы создаем биосенсоры, способные чувствительно обнаруживать антиапоптозный белок BCL-2, Fc-домен IgG1, рецептор HER2 и ботулинический нейротоксин В, а также биосенсоры сердечного тропонина I и антитела к вирусу гепатита В с высокой чувствительностью. необходимо для клинического обнаружения этих молекул. Учитывая необходимость в диагностических инструментах для отслеживания коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2)3, мы использовали подход к созданию сенсоров на спайковый белок SARS-CoV-2 и антитела против мембранных и нуклеокапсидных белков. Первый, который включает в себя разработанный de novo связующий домен связывающего домена спайкового рецептора (RBD)4, имеет предел обнаружения 15 пМ и сигнал люминесценции в 50 раз выше фонового уровня. Модульность и чувствительность платформы должны позволить быстро создавать датчики для широкого спектра аналитов и подчеркивают возможности дизайна белков de novo для создания многосостоятельных белковых систем с новыми и полезными функциями.

Биосенсоры на основе белков играют важную роль в синтетической биологии и клинических приложениях, но конструкция биосенсоров до сих пор в основном ограничивалась реинжинирингом природных белков1. Найти специфические домены, связывающие анализируемые вещества, которые претерпевают конформационные изменения при связывании, является сложной задачей, и даже если они доступны, обычно требуются обширные усилия белковой инженерии для эффективного связывания их с репортерным доменом5,6. Поэтому желательно создавать модульные биосенсорные платформы, которые можно легко перепрофилировать для обнаружения различных белковых мишеней, представляющих интерес. Модульные системы были разработаны для обнаружения антител7,8,9 и малых молекул10,11, но общие белковые сенсоры представляют собой более сложную задачу, учитывая большое разнообразие белковых структур, размеров и состояний олигомеризации, а также таких подходов, как полусинтетические белковые платформы12,13,14. , или переключатели кальмодулина15,16, обычно требуют тщательного скрининга для поиска потенциальных кандидатов из-за ограниченной предсказуемости17.

Белковый биосенсор может быть построен на основе системы с двумя почти изоэнергетическими состояниями, равновесие между которыми модулируется измеряемым аналитом. Желательными свойствами такого сенсора являются: (i) конформационные изменения, вызываемые аналитом, должны быть независимыми от деталей аналита, поэтому одну и ту же систему в целом можно использовать для обнаружения множества различных целей; (ii) система должна быть настраиваемой, чтобы аналиты с разными энергиями связи и разными типичными концентрациями могли обнаруживаться в широком динамическом диапазоне; и (iii) конформационные изменения должны быть связаны с чувствительным результатом. Мы предположили, что эти атрибуты могут быть достигнуты путем инвертирования информационного потока в белковых переключателях, сконструированных de novo, в которых связывание с интересующим белком-мишенью контролируется присутствием пептидного актуатора2. Мы разработали систему, состоящую из двух белковых компонентов: во-первых, «lucCage», который включает клеточный домен и домен-защелку, который содержит мотив связывания с мишенью и расщепленный фрагмент люциферазы (маленький BiT (SmBiT) 114)18; и, во-вторых, «lucKey», который содержит ключевой пептид, который связывается с открытым состоянием lucCage и комплементарным расщепленному фрагменту люциферазы (большой BiT (LgBit) 11S)18 (рис. 1a). lucCage имеет два состояния: закрытое состояние, в котором домен клетки связывается с защелкой и стерически не позволяет мотиву связывания связываться с мишенью и SmBiT от объединения с LgBit для восстановления активности люциферазы, и открытое состояние, в котором эти взаимодействия связывания не заблокирован, и LucKey может привязываться к домену клетки. Ассоциация LucKey с LucCage приводит к восстановлению активности люциферазы (рис. 1а, справа). Термодинамика системы настроена так, что свободная энергия связи lucKey с lucCage (ΔGCK) недостаточна для преодоления стоимости свободной энергии открытия lucCage (ΔGopen) в отсутствие цели (ΔGopen − ΔGCK >> 0), но в В присутствии мишени дополнительная свободная энергия связи фиксатора с мишенью (ΔGLT) приводит к открытию фиксатора и восстановлению люциферазы (ΔGopen – ΔGCK – ΔGLT << 0) (рис. 1б, в). Эта система удовлетворяет свойствам (i) и (ii), указанным выше, поскольку можно ограничить широкий спектр связывающих активностей, а поскольку переключатель термодинамически контролируется, энергии связывания LucKey и мишени можно регулировать для достижения активации при соответствующих целевых концентрациях. Поскольку LucKey и LucCage всегда одни и те же, система является модульной: одна и та же молекулярная ассоциация может быть связана с связыванием множества различных мишеней. Биолюминесценция обеспечивает быстрое и чувствительное считывание определяемой аналитом ассоциации lucCage-lucKey, удовлетворяющей свойству (iii).